สองพี่น้องกลับมาอีกครั้งในการผจญภัยครั้งใหม่ล่าสุดบนท้องทะเลอันกว้างใหญ่! ออกเรือไปกับ Mario และ Luigi บน Shipshape Island (ส่วนหนึ่งเป็นเรือ ส่วนหนึ่งเป็นเกาะ) แล้วท่องไปในโลกกว้างของ Concordia พุ่งทะยานออกจากปืนใหญ่ของ Shipshape เพื่อไปเยือน สำรวจ และทำภารกิจบนหมู่เกาะน้อยใหญ่หลากหลาย ตั้งแต่ป่าฝนเขตร้อน ไปจนถึงนครที่คึกคัก ระหว่างทาง จะได้พบเพื่อนใหม่อย่าง Connie กับ Snoutlet (ซึ่งไม่ใช่หมูแน่นอน) และจะได้เจอคนคุ้นเคยจาก Mushroom Kingdom อย่าง Peach กับ Bowser ที่อาจมาช่วยเหลือ...หรือขัดขวาง...การเดินทาง!

พึ่งพาสายสัมพันธ์พี่น้องของ Mario กับ Luigi เพื่อก้าวข้ามทุกสิ่ง ใช้ Bros. Moves ฝ่าสิ่งกีดขวางขณะสำรวจ หรือใช้ Bros. Attacks อันทรงพลังเพื่อคว้าชัยในการต่อสู้รูปแบบเทิร์นเบส ผู้เล่นจะต้องใช้ทุกข้อได้เปรียบซึ่ง "พี่น้อง" คู่นี้มอบให้เพื่อฟันฝ่าอุปสรรค!